在普通细胞系中能够正常工作的电转条件，换到原代细胞、T细胞、NK细胞或者干细胞以后，经常会出现不同的结果。最典型的问题就是：电转后细胞死亡明显增加。有时甚至会出现一种非常尴尬的情况——阳性率看起来不错，但培养一段时间以后，大量细胞死亡，最终真正能够用于后续实验的有效细胞数量并不多。对于珍贵样本来说，这种失败的成本尤其高。为什么这些细胞更难做？一、“难转染”并不只是转染效率低很多人理解的难转染细胞，就是外源物不容易进入。实际上，“难转染”往往还包括另一个问题：细胞对操作过程更加...

做电转实验时，一个非常容易陷入的误区就是：不断寻找所谓的“最佳电压”。网上搜索某种细胞的电转条件，经常会看到类似“多少伏效果好”的经验参数，于是直接复制到自己的实验中。结果却可能不同。有人得到较高的转染效率，有人却出现严重的电转后细胞死亡，还有人虽然细胞活率很好，但是几乎没有明显递送效果。为什么同样的参数会产生如此大的差异？原因在于，电穿孔从来不是由一个电压参数决定的，而是由细胞、波形、电场、脉冲时间、递送体系和恢复条件共同决定的。一、电压相同，不代表细胞受到的电场相同一个非...

在细胞电转实验中，“电转后细胞死亡”是非常常见的问题。尤其是在原代细胞、免疫细胞、干细胞以及部分难转染细胞实验中，经常会出现这样的情况：转染效率看起来提高了，但细胞活率明显下降；或者刚完成电转时细胞状态尚可，培养数小时后却出现大量死亡。遇到这种情况，很多实验人员第一反应就是：是不是电压太高了？电压确实可能是原因，但并不是原因。如果只是一味降低电压，很可能出现另一个问题——细胞活下来了，递送效率却明显下降。因此，解决电转后细胞死亡问题，关键不是简单追求“低电压”，而是找到细胞损...

很多实验室做电转的方式是这样的：第一次问同事参数。第二次查论文。第三次根据感觉加一点电压。第四次觉得细胞死得多，再降一点。经过十几次实验以后，终于得到一个还不错的结果。但是过了两个月，换一个人重新做，又开始从头试。这说明实验室获得了一组参数，却没有真正建立电转参数优化体系。对于长期进行细胞转染、基因编辑以及核酸递送的实验室来说，更有价值的不是“记住一个数字”，而是形成一套能够重复使用的方法。一、第一层：建立基础实验档案每次电转至少保存几类信息。1.细胞信息细胞名称；来源；培养...

电转完成之后，显微镜下一看：细胞碎片明显增加。第二天检测活率，比对照组低很多。继续培养以后，细胞恢复也比较慢。这时候很多人的第一反应是：“是不是电压太高了？”有可能。但不一定只有这个原因。电转后细胞死亡率高，本质上应该按照完整实验流程排查，而不是只降低某一个参数。一、首先判断：是不是电刺激过强电转需要利用电脉冲使细胞膜暂时形成有利于外源物进入的状态。但是刺激过强，同样可能增加细胞损伤。因此电转一直存在一个基本矛盾：刺激太弱，递送效率不足；刺激太强，细胞损伤增加。ThermoF...

很多实验人员第一次做原代细胞、T细胞、NK细胞、PBMC或者其他难转染细胞时，会先搜索：“某某细胞电转参数是多少？”然后找到一篇论文或者一个实验帖子，直接复制其中的电压、脉宽和脉冲次数。如果第一次结果不错，当然很好。但更常见的情况是：别人能做到的效率，自己做不到；甚至同样的参数，第一批细胞效果不错，第二批就明显下降。这并不一定说明设备有问题。对于原代细胞和免疫细胞来说，电转参数优化本身就应该允许一定的生物学差异存在。公开的细胞转染数据库中，同一种细胞在不同程序、体系和样品条件...

“参数已经调了很多次，为什么电转效率还是上不去？”这是电转实验中非常常见的问题。有些实验连续提高电压，有些不断延长脉冲时间，还有一些直接照搬别人发表论文中的参数，但最后效果依然不稳定。问题往往在于：电转效率不是由一个参数决定的。电转设备上的电压、脉宽只是整个实验系统的一部分。真正有效的电转参数优化，应该把细胞、递送物、缓冲体系、电转杯、脉冲条件以及恢复培养放在同一个体系中考虑。一、先排查细胞状态很多人调参数时，最容易忽略的恰恰是细胞。同一种细胞，不同培养状态下对电刺激的耐受能...

做过电转实验的人，可能都遇到过类似情况：电压往上调，阳性率确实提高了一些，但第二天细胞死了一大片；参数调得温和之后，细胞活得不错，转染效率却又下来了；好不容易找到一组效果不错的条件，换一批细胞、换一个操作者，结果又发生明显变化。这也是为什么电转参数优化很少能够靠“别人给我一个电压和脉宽，我直接照着做”解决。从实验应用角度看，真正理想的电转条件，并不是单纯追求最高转染效率，而是在转染效率、细胞存活率以及实验重复性之间找到适合当前研究目的的平衡点。ThermoFisher的电转资...