对于很多第一次开展mRNA电转实验的研究人员来说，最让人头疼的问题并不是没有表达，而是：mRNA确实进入细胞了，但细胞死亡也非常严重。有时电转后短时间观察似乎没有异常，培养几个小时以后细胞状态却明显变差；有时阳性率提高了，但存活细胞数量却明显减少。这种情况下，如果只盯着mRNA转染效率，很容易走进参数优化误区。因为对于mRNA电转而言，真正有意义的指标通常不是单纯追求最高阳性率，而是需要同时考虑转染效率和细胞活率。一、场强过高是常见原因，但不是原因电穿孔的基本原理，是利用短时...

在mRNA递送实验中，“转染效率低”几乎是很多研究人员都会遇到的问题。尤其是刚开始进行mRNA转染时，看到阳性率不理想，很多人的第一反应往往是：是不是电压不够？是不是需要继续提高电转强度？实际上，mRNA转染并不是简单的“电压越高，进入细胞的mRNA越多”。对于原代细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞以及部分干细胞而言，过度提高电转强度，反而可能带来明显的细胞损伤。最终虽然短时间内看到了部分mRNA进入细胞，但细胞活率下降、状态变差，后续实验仍然很难获得理想结果。因此，判断mR...

随着CRISPR技术在基因功能研究、疾病模型、细胞工程和生物医药研究中的应用越来越广，电穿孔仪也逐渐成为许多实验室进行CRISPR递送的重要设备。但真正准备采购时，很多用户都会遇到一个问题：市面上的电穿孔设备不少，参数也很多，做CRISPRCas9电转到底应该重点看什么？如果只比较最高电压、外观或者价格，很容易忽略真正影响长期使用的部分。第一，看自己的主要样本是什么不同实验室的CRISPR研究方向差异很大。有些主要做常规细胞系；有些以原代细胞为主；有些研究T细胞、NK细胞、P...

在常规细胞系中已经做通CRISPR实验，并不意味着换成原代细胞以后同样可以顺利复制。很多研究人员第一次进行原代细胞CRISPRCas9电转时都会发现一个明显变化：参数变得更加“敏感”了。稍微温和一些，编辑效率不够；稍微加强一点，细胞活率又快速下降。这并不罕见。相较于部分长期培养、适应性较强的细胞系，原代细胞通常对外界刺激更加敏感，可接受的电转条件窗口也可能更窄。为什么CRISPR越来越需要考虑原代细胞？随着基因功能研究、疾病模型、细胞治疗以及精准医学研究不断深入，很多项目已经...

第一次做CRISPRCas9电转时，很多实验人员最想知道的一个问题就是：“到底应该设置多少伏？”但如果真正长期做过电转实验，就会发现这个问题并没有一个适用于所有实验室的标准答案。因为CRISPRCas9电转参数并不是只由Cas9决定，而是由细胞、递送物、电转体系以及实验目标共同决定。所以，与其寻找一套网络上所谓的“标准参数”，不如建立一套可以持续复用的参数优化方法。第一步：先确定你到底在递送什么CRISPRCas9实验常见的递送形式包括Cas9质粒、Cas9mRNA以及Cas...

做CRISPR基因编辑时，最让实验人员头疼的情况之一，就是电转前细胞状态很好，电转完成几个小时后却开始大量死亡。尤其是在原代细胞、干细胞、免疫细胞等对外界刺激较敏感的样本中，这种情况更加常见。很多人因此会认为：CRISPRCas9电转是不是本身就特别伤细胞？其实，电穿孔确实会暂时改变细胞膜通透性，但细胞死亡严重并不意味着电转方法本身不可用，更常见的原因是脉冲条件、细胞状态和实验流程之间没有达到合适平衡。电转不是电压越低越安全有些实验人员发现高电压导致细胞死亡后，会直接大幅降低...

在CRISPR基因编辑实验中，很多研究人员都会遇到一个比较典型的问题：Cas9、sgRNA都准备好了，细胞状态看起来也没有明显异常，但真正完成电转之后，编辑效率却始终达不到预期。于是很多人的第一反应就是：是不是电压不够？实际上，在CRISPRCas9电转过程中，单纯提高电压并不一定能够换来更高的编辑效率。相反，如果电场强度超过细胞耐受范围，还可能出现大量细胞死亡，最终形成“导入提高了一点，但有效活细胞减少很多”的情况。CRISPRCas9电转真正要看的，是整个导入过程CRIS...

电穿孔实验看起来流程并不复杂：准备样品、加入核酸、装入电转杯、设置参数、进行脉冲。但真正开始实验之后，很多人会发现结果并没有想象中稳定。尤其刚开始接触电转技术时，如果连电转染和电转化的区别都没有弄清楚，就容易把不同实验体系的方法混在一起。下面从实际实验角度，把两者区别以及常见失败原因梳理一次。一、电转染与电转化最大的不同是什么？简单来说：电转染更多用于将外源核酸等分子导入哺乳动物细胞等真核细胞；电转化更多用于将DNA导入细菌、酵母等微生物体系。两者的共同点都是利用短时间电脉冲...