做电转实验时，很多人会重点记录电压、脉宽和脉冲次数，却很容易把样品体积当成一个无关紧要的条件。例如原来使用100μL体系，后续因为细胞数量或者样品量发生变化，将体系调整到200μL。电压等设置没有改变，但实验表现却与之前不同。出现这种情况并不奇怪。电转体系中的液体并不是单纯负责“装细胞”，它同时也是整个放电回路的一部分。一、为什么样品体积也属于电转条件在电转杯中，电极、缓冲液和样品共同组成一个电学体系。当电脉冲施加以后，电流会通过样品液体。因此，样品的体积、电导率、电极间距以...

实验过程中为了方便保存和批次管理，很多细胞都会经过冻存。需要实验时再从液氮中取出复苏。不过，当后续实验涉及电转时，一个容易被忽略的问题是：细胞刚刚复苏完成以后，能不能直接进行电转？从实验控制角度来看，一般不建议单纯根据“已经复苏多少小时”决定是否进行电转，更重要的是判断细胞是否真正恢复到了适合实验的状态。一、复苏完成只是细胞恢复过程的开始细胞从冻存状态恢复到培养状态，需要经历温度变化、冻存保护剂去除、渗透压重新平衡以及重新适应培养环境等过程。显微镜下看到细胞已经存在，并不代表...

电转完成以后，很多实验人员最先关注的是结果什么时候能够看到。有的人做完几个小时就开始检测，也有人习惯第二天统一观察。实际上，“电转后多久检测”并不存在一个适用于所有实验的固定答案，因为检测时间不仅和电转过程有关，更和导入物类型、检测指标以及细胞自身的生物学过程有关。如果检测时间选择不合适，即使电转本身已经成功，也可能得到“信号很弱”“没有明显变化”甚至“实验失败”的判断。因此，在安排实验时，检测时间最好和电转条件一起提前设计。一、电转完成不等于马上出现最终结果电转的主要作用，...

在细胞工程、免疫细胞研究以及部分基因编辑实验中，mRNA电转是一种常见的递送方式。与质粒DNA相比，mRNA进入细胞后不需要先进入细胞核再进行转录，而是可以直接参与后续蛋白表达。也正因为如此，mRNA电转在一些对快速、短期表达有要求的实验中具有明显应用价值。但实际实验中，mRNA电转并不是简单地把“质粒换成mRNA”。一、首先要明确实验需要短期表达还是长期表达mRNA的一个重要特点是表达相对快速，但通常不会像某些DNA表达体系那样持续很长时间。因此，如果实验目的本身就是短期获...

CRISPR基因编辑实验中，电转是一种常见的递送方式。无论是质粒、mRNA还是Cas9蛋白与sgRNA形成的RNP复合物，都可以根据实验体系采用电转进行递送。但实际操作中，很多实验人员会遇到一个问题：电转以后细胞看起来正常，甚至能够检测到一定递送信号，但最终基因编辑效率却没有达到预期。这时候就不能简单把问题归结为“电转效率低”。一、递送成功不等于编辑成功CRISPR实验至少可以拆成几个过程：首先是材料进入细胞；随后Cas9与sgRNA正常发挥作用；再产生目标位点切割；最后由细...

相比常见的稳定细胞系，原代细胞电转通常更让实验人员头疼。同样的电转程序，在293T、CHO等细胞上可能很容易获得结果，但换成原代细胞后，常见情况就变成了：电转效率不够、细胞死亡较多、不同批次之间重复性明显下降。这并不意味着电转技术不适合原代细胞，而是因为原代细胞本身对实验条件更加敏感。一、不同来源的原代细胞不能简单套用同一套参数“原代细胞”实际上是一个非常大的范围。原代成纤维细胞、原代免疫细胞、原代肝细胞、原代神经细胞以及不同组织来源的细胞，在细胞大小、膜状态、培养条件以及耐...

实验室里经常会出现一种让人头疼的情况：同一种细胞、同一台电穿孔仪、同一个电转程序，第一次效果很好，第二次一般，第三次突然又变差。很多人首先怀疑设备是不是不稳定。但从实际实验流程来看，电转结果出现波动，并不一定是仪器本身的问题。细胞电转是一个对样本状态和实验操作都比较敏感的过程。首先，不同批次细胞的状态可能已经存在差异。即使细胞名称相同，只要融合度、传代次数、生长速度或者复苏时间不同，对电刺激的响应就可能发生变化。特别是一些对培养条件比较敏感的细胞，在显微镜下看起来差别并不明显...

很多实验人员第一次做细胞电转时，会把注意力集中在转染效率上。但实际实验中，更常见的问题往往是：电转之后细胞死得太多。显微镜下可以看到细胞数量明显减少，部分细胞漂浮，贴壁细胞恢复缓慢，甚至第二天几乎没有可继续培养的细胞。出现这种情况，并不能简单理解为“电转伤细胞”。电穿孔本身确实会对细胞膜造成短暂影响，但在合适条件下，细胞膜可以逐渐恢复。如果大量细胞死亡，通常说明电刺激强度、样品状态或者操作流程中存在不匹配。首先需要考虑的是脉冲强度。电压过高、脉宽过长或者脉冲次数过多，都可能增...